In vitro оцінка неоколагенезу після обробки філером Neauvia Stimulate

Neauvia Stimulate® - це біологічно сумісний ін’єкційний філер на основі гіалуронової кислоти (ГК) (26 мг/мл), зшитою з ПЕГ та 1% гідрокиапатиту кальція (КаГА), призначений для реконструкції м’яких тканин обличчя із наданням тканинам додаткового об’єму за рахунок неоколагенезу, що покращує якість шкіри. Завданням представленого дослідження була оцінка можливих змін синтезу колагену після обробки досліджуваним продуктом (партія 160517-26-1/2 PEG) людських фібробластів в умовах in vitro. Незважаючи на in vitro умови, запропонована експериментальна модель надавала корисну інформацію, що дозволяла передбачити можливу активність досліджуваного продукту при in vivo застосуванні у майбутньому. Людські фібробласти (клітини PEU) протягом 24 годин оброблялись збільшуваними концентраціями досліджуваного продукту і порівнювались з контролем (необроблені клітини). Модуляція синтезу колагену оцінювалась за допомогою спеціального колориметричного набору (Sircol, Soluble Collagen Assay Kit). Мало місце статистично значуще зростання виробництва колагену на 37.62% і 97.39% після обробки досліджуваним продуктом у концентрації відповідно 1.25 мг/мл та 2.5 мг/мл (* значення p <0.05 і ** значення p <0.01) відносно контролю (необроблені клітини). У висновку зазначено, що гідрогель гіалуронової кислоти 26 мг/мл зшитий з ПЕГ та низькою концентрацією гідроксиапатиту кальцію (1%) забезпечує статистично значуще підсилення неоколагенезу.

Single post image

 

Neauvia Stimulate® (MatexLab SA, м. Лугано, Швейцарія) – це продукт, який поєднує чисту гіалуронову кислоту пробіотичного походження (Bacillus Subtilis) зшитою з ПЕГ (поліетиленгліколь) та низькою концентрацією (1%) макромолекул (10-12 пм) гідроксіапатиту кальцію. Цей продукт відноситься до «гібридних» філерів (повна біологічна сумісність та біорозкладання), які одночасно забезпечують колагенез та ефект збільшення об’єму, типовий для пегильованих ГК філерів (1,2, 3) («пегильований» або «зшитий» означає утворення перехресних зв’язків з поліетиленгліколем). Колагенез досягається за рахунок дії гідроксиапатиту кальцію, який стимулює ендогенне виробництво колагену в шкірі (4, 5, 6, 9).

Завданням представленої роботи була оцінка можливої модуляції синтезу колагену після обробки культивованих в умовах in vitro людських фібробластів гідрогелем гіалуронової кислоти 26 мг/мл, зшитої з ПЕГ та 1% гідроксипатитом кальцію (партія 160517-26-1/2 PEG). Незважаючи на in vitro умови, запропонована експериментальна модель надає корисну інформацію, що дозволяє передбачити можливу активність досліджуваного продукту при in vivo застосуванні у майбутньому.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Приготування досліджуваного зразка

Пегильований гідрогель гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) зважувався і розчинявся в концентрації 5 мг/мл в повному живильному середовищі MEM з 10% телячої ембріональної сироватки (FBS), 1 мM L-глутаміну та антибіотиками (пеніцилін 100 МО/мл та стрептоміцин 100 пг/мл). У якості позитивного контролю використовувалась добре відома цитотоксична речовина лаурилсульфат натрію (ЛСН), яка готувалась так же, що й досліджуваний продукт.

Клітинні культури

Фібробласти – це клітини сполучної тканини, що виробляють компоненти позаклітинного матриксу. В експерименті використовувалась людська клітинна лінія нормальних ембріональних фібробластів (PEU, код BS CL 97). Клітинна лінія вирощувалась в умовах повної стерильності і інкубувалась при 37°C в атмосфері з 5% оксиду вуглецю.

Аналіз цитотоксичності (тест MТT)

Тест МТТ – це колориметричний аналіз цитотоксичності, що використовується для оцінки проліферації клітин та їх життєздатності на основі мітохондріальної ефективності. МТТ – це сіль тетразолію, яка за наявності метаболічної активності в клітині відновлюється метохондріальною дегідрогеназою в середовищі мітохондрії життєздатної клітини. Відновлення МТТ призводить до утворення кристалів формазану (малюнок 1), які не розчиняються в культуральному середовищі, але розчиняються в диметилсульфоксиді, внаслідок чого мітохондрія життєздатної клітини забарвлюється у типовий пурпурний колір. В ураженій або загиблій клітині активна мітохондрія відсутня, тому МТТ не виробляється і, відповідно, не відбувається інтенсивного забарвлення в пурпурний колір (7). Існує прямий зв’язок між життєздатністю та клітинним диханням, тому МТТ було визнано надійним аналізом для виявлення нецитотоксичних концентрацій гідрогелю пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG).

При підготовці до аналізу клітини PEU рівномірно висівались на 96-лункові планшети із щільністю 1.5 x 104 клітин/лунка, після цього проводилась інкубація при 37°C у вологій атмосфері з 5% вмістом вуглекислого газу. Через 24 години виконувалась обробка клітин (6 реплікацій кожної лунки 8 різними концентраціями), починаючи з концентрації 5 мг/мл і до кінцевої концентрації 0.039 мг/мл з послідовним розведенням 1:2. У якості позитивного контролю використовувались клітини оброблені ЛСН (Ктрл+, початкова концентрація в повному середовищі 5 мг/мл).

Інкубація тривала 24 години. Після цього до клітин PEU додавалось 10 мкл основного розчину МТТ (5 мг/мл в фосфатному буферному розчині) при 37°C на 2 години. Після цього видалялось культуральне середовище і до клітин додавалось 100 мкл диметилсульфоксиду. Вимірювалось оптичне поглинання на довжині хвиль 570 нм мікропланшетним рідером (Tecan Sunrise). Життєздатність клітин розраховувалась за різницею оптичної густини кожної з восьми досліджуваних концентрацій випробуваного продукту відносно контролю (необроблені клітини) (8).

Оцінка синтезу колагену

Здатність гідрогелю пегильованої гіалоронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) модулювати виробництво колагену оцінювалась у людських фібробластах (клітини PEU) після 24-годинної обробки досліджуваним продуктом. Для вимірювань використовувався колориметричний набір (Sircol, Soluble Collagen Assay Kit). При підготовці до аналізу клітини PEU рівномірно висівались на 96-лункові планшети із щільністю 8 x 104 клітин/лунка, після цього проводилась інкубація при 37°C у вологій атмосфері з 5% вмістом вуглекислого газу.

Через 48 годин досліджувались дві концентрації випробуваного продукту, 1.25 та 2.5 мг/мл, які були вибрані через відсутність цитотоксичності та хорошу розчинність (необхідну для МТТ тесту). В якості контролю використовувались необроблені клітини (КТРЛ). Після інкубації до супернатанту, що утворювався, додавалось 200 мкл Tris-HCl (pH 7.4) з поліетиленгліколем для відокремлення та концентрування колагену. Після цього – зберігання протягом ночі при 0 — 4°C. У подальшому зразки центрифугувались при 12 000 об/хв. та інкубувались 10 хвилин з реактивом «барвник Sircol», здатним зв’язуватись з колагеном. За цей час утворювались комплекси колаген-барвник, які осаджувались з розчину незв’язаного барвника. Після центрифугування (10 хвилин із швидкістю 12 000 об/хв.) додавався реактив з гідроксидом натрію 0.5 M, що розчиняв осаджений колаген. Потім 200 мкл зразка переносилось на 96-лунковий планшет для спектрофотометричного вимірювання оптичної густини на довжині хвиль 555 нм.

РЕЗУЛЬТАТИ

Отримані результати повідомлялись у формі таблиць та графіків, які містили дані вимірювань синтезу колагену після обробки гідрогелем пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) у порівнянні з контрольними клітинами PEU. Дані повідомлялись як середні значення ± стандартне відхилення (SD) щонайменш для двох виконаних за раз незалежних експериментів.

In vitro оцінка неоколагенезу після обробки філером Neauvia Stimulate

In vitro оцінка неоколагенезу після обробки філером Neauvia Stimulate

In vitro оцінка неоколагенезу після обробки філером Neauvia Stimulate

Оцінка життєздатності клітин

Клітини PEU інкубувались та оброблялись протягом 24 годин 8 концентраціями гідрогелю пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) та відповідним позитивним контролем для визначення робочих концентрацій для подальшого аналізу На мал. 2 показані результати випробування цитотоксичності. На цьому графіку видно, що всі випробувані концентрації гідрогелю пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) не мали цитотоксичної активності.

В таблиці 1 для кожної випробуваної концентрації показані дані вимірювань, що представлені у відсотках відносно контролю (необроблені клітини). З цих даних випливає, що за всіх випробуваних концентрацій гідрогель пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) не мав цитотоксичної активності. Для подальшого аналізу були вибрані робочі концентрації 1.25 мг/мл та 2.5 мг/мл через їх хорошу розчинність в культуральному середовищі.

Оцінка синтезу колагену

Клітини PEU оброблялись (інкубація 24 години) двома різними концентраціями гідрогелю пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) (2.5 мг/мл та 1.25 мг/мл) для дослідження ступеню можливої модуляції синтезу колагену. На мал. 3 представлені результати обробки клітин PEU гідрогелем пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) в концентрації 1.25 мг/мл та 2.5 мг/мл. Ці результати показують, що порівняно з контролем (КТРЛ, необроблені клітини) 24-годинна обробка клітин PEU обома робочими концентраціями досліджуваного продукту підвищували рівень синтезованого колагену відповідно на 37.62% та 97.39%.

ВИСНОВКИ

На підставі результатів in vitro випробувань автори дійшли висновку, що гідрогель пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) спричиняв статистично значуще підвищення синтезу колагену людськими фібробластами після їх 24-годинної обробки двома робочими концентраціями досліджуваного гідрогелю. Зокрема робочі концентрації гідрогелю пегильованої гіалуронової кислоти 26 мг/мл (партія 160517-26-1/2 PEG) 1,25 мг/мл та 2,5 мг/мл підвищували виробництво колагену в клітинах PEU відповідно на 37.62% та 97.39%.

 

Адреса для листування:

Д-р Роберто Мокчі (Roberto Mocchi),

UB-CARE S.r.l.,

Університет м. Павія, Італія.

Тел.: 0382 986040

Ел. пошта: marketing@ub-careitaly.it

0393-974X (2016)

Copyright © by BIOLIFE, s.a.s. Ця публікація (стаття) виключно для індивідуального використання і не призначена для тиражування без письмового дозволу власника авторських прав. Несанкціоноване тиражування статті може бути покаране штрафом або іншими видами переслідування.

КОНФЛІКТ ІНТЕРЕСІВ: АВТОРИ СТАТТІ ЗАЯВИЛИ ПРО ВІДСУТНІСТЬ КОНФЛІКТУ ІНТЕРЕСІВ.