Морфологічні зміни в шкірі після обробки пегильованим філером

В цьому дослідженні вивчались мікроскопічні, гістохімічні та мікроструктурні зміни людської шкіри за 8 місяців після ін’єкції нового пегильованого філера. Морфологічні дані показали відмінну інтеграцію філера із компонентами сполучної тканини та ефективне взаємне проникнення з основною речовиною. Спостерігався рівномірний розподіл філера в гіподермі. Не було виявлено жодних ознак сегрегації чи інкапсуляції клітин або інших структур, та імунологічних побічних реакцій. Крім того, тонкі структурні зміни фібробластів свідчили про стимуляційний ефект щодо виробництва молекулярних компонентів позаклітинного матриксу, що сприяло відновленню сполучної тканини шкіри.

Філери на основі гіалуронової кислоти (ГК) через дуже сприятливі структурні, реологічні та фізіологічні властивості набули широкого застосування в косметиці, біомедицині та естетичній медицині для корекції дефектів і відновлення об’єму шкіри. ГК характеризується високою вологоутримуючою здатністю, в’язко-еластичністю, водним балансом, опором текучості, змащувальною та стабілізуючою дією на сполучну тканину. При цьому ГК не виявляє токсичності чи імуногенності.

Вперше високоочищену ГК було отримано і запатентовано в 1979 році. Речовину було екстраговано з курячих пуповин та півнячих гребенів (1). Потім були розроблені та почали випускатись гідрогелі з ГК з інших тваринних матеріалів, які підходили для уведення до сполучної тканини шкіри (2, 3, 4). У подальшому екстрагування ГК з тваринних матеріалів було замінено виробництвом шляхом мікробної ферментації Streptococci (5). Однак через потенційну вихідну патогенність (залишки ДНК бактерій та певних пептидів, що лишались після промислового виробництва) такій ГК була властива імуногенність, що зумовлювало ризики її застосування.

У наступні роки поява більш сучасних технологій дала змогу почати промислове виробництво неімуногенної ГК з рекомбінантної Bacillus subtilis (6). Проводились експерименти з різними концентраціями ГК та ступенями зшивки (утворення перехресних зв’язків), з одно- та двохфазними гелями (7). Для зменшення токсичності, підвищення біологічної сумісності та довготривалої ефективності також були розроблені і вдосконалені спеціальні зшивні агенти. Спочатку в цій якості досліджувались таких речовини, як дивінілсульфон та дигліциділовий ефір 1,4-бутандіолу, але врешті решт було обрано полімер етиленгліколю поліетиленгліколь (ПЕГ), який після так званого пегилювання ГК, тобто утворення перехресних зв’язків (зшивка) (8, 9, 10), забезпечував найкращі переваги щодо безпеки та ефективності гелю.

ПЕГ та ГК є полімерами і при їх зшивці утворюється матриця з клітковим каркасом (11, 12, 13) у формі тривимірної мережі з взаємно проникаючими вузлами та зв’язками. Така будова забезпечує кращу інтеграцію філера до сполучної тканини. За рахунок цього ця структура здатна утримувати та поступово виділяти молекули, що регенерують шкіру.

З урахуванням вищесказаного автори вибрали для цього дослідження новий філер на основі ГК, отриманої ферментаційним процесом з використанням спеціального штаму бактерій Bacillus subtilis (непатогенний штам з класу пробіотиків). Ця ГК сполучалась з ПЕГ за допомогою зшивки двох полімерів (пегелювання), що давало змогу отримати тривимірний молекулярний клітковий каркас, який забезпечує кращу інтеграцію з компонентами сполучної тканини, більшу тривалість терапевтичного ефекту філеру та кращу опірність шкіри термічним та механічним навантаженням.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

В дослідженні приймали участь п’ять добровольців, яким в гіподерму виконувались субдермальні ін’єкції малих об’ємів (1 мл) пегельованого філера на основі гіалуронової кислоти (Neauvia Stimulate®) і за вісім місяців виконувалась біопсія шкіри.

Світлова мікроскопія

Біопсійні зразки відразу занурювались у фіксуючий розчин 4% парафоральдегіду/фосфатного буфера на 24 годин і потім досліджувались під світловим мікроскопом (зрізи зневоднених та залитих парафіном зразків). Зрізи товщиною 7 мкм фарбувались гематоксиліном та еозином (ГіЕ), інші суміжні зрізи фарбувались 30 хвилин 1% розчином алціанового блакитного та 3% оцтовою кислотою. Мікроскопічне дослідження виконувалось під мікроскопом Carl Zeiss Axioplan, обладнаного 5-мегапіксельною кольоровою ПЗС камерою високої роздільної здатності Nikon DS-Fi2.

Електронна мікроскопія

Фіксація виконувалась зануренням біопсійних зразків до 2.5% глутаральдегіду — 2% параформальдегіду в буферному розчині 0.1M какодилату натрію (pH 7.3), 6 годин при 4°C. Постфіксація зразків виконувалась 2 години в 1.33% тетроксиді осмію в 0.1M s-колідиновому буфері із наступним зневодненням в серіях етанолу в зростаючій концентрації. Потім зразки заливали епоксидною смолою Epon 812 і нарізали ультратонкі зрізи (40-60 нм) на ультрамікротомі Reichert Ultracut S з алмазним ножем Diatome. Напівтонкі зрізи (0,2 мкм), які виконувались для вибору ділянок для обстеження, фарбувались толуїдином блакитним та досліджувались під мікроскопом Zeiss Axioplan з спеціальними фільтрами для диференційно-інтерференційного контрастування.

Ультратонкі зрізи після збору на сітках 200 меш контрастно фарбувались цитратом свинцю та ацетатом уранілу. Дослідження та електронні мікрографії виконувались на трансмісійному електронному мікроскопі Zeiss EM 10 з робочою напругою 80 кВ та величиною апертури об’єктиву 30/60 мкм. Зображення реєструвались на плівці для електронних зображень Kodak 4489 Electron Image, після цього оцифровувались сканером Epson Perfection V750 Pro з роздільною здатністю 1200 крапок на дюйм.

РЕЗУЛЬТАТИ

При світловій мікроскопії зрізів біопсійних зразків загальний огляд під невеликим збільшенням показував добре розмежування різних шарів шкіри, а саме: епідермісу (EP), дерми (D) та гіподерми (HD) (мал. 1).

На зрізах фарбованих ГіЕ (мал. 1, HЕ) було видно дифузні еозинофіли (червонуваті) в дермі внаслідок великої кількості пучків колагенових волокон малого та середнього розміру. В гіподермі великі пучки колагенових волокон перемежовувались більш світлими ділянками, що мали іншу форму і в основному розташовувались поряд з волокнами. Ці ділянки мали світло-блакитний колір через вміст філеру в базофільному матеріалі. В центрі (посередині) та у нижній частини зображення HE спостерігались певні малі округлі утворення з чіткими межами (окремі або всередині білої маси жирової тканини), які відповідали потовим залозам та їх вивідним протокам.

Показаний на мал. 1Ab зріз фарбувався алціановим блакитним для забарвлення кислотних полісахаридів та глікозаміногліканів. В дермі спостерігалось ледь блакитне забарвлення структур, утворених гіалуроновою кислотою з протеогліканами, глікозаміногліканами і глікопротеїнами, які в основному походили з основної речовини. В гіподермі чітко вирізнявся матеріал, інтенсивно забарвлений алціановим блакитним (мал. lAb), найвірогідніше через високий вміст пегильованої гіалуронової кислоти, що потрапила в цю ділянку шкіри при уведенні філера. Як відомо, алціановий блакитний відрізняється специфічністю до кислотних полісахаридів та глікозаміногліканів, і це зумовило специфічне фарбування численних ділянок. Ці ділянки відповідали основній речовині з інтегрованим до неї філером при його розподілі між колагеновими волокнами; при цьому альціановий блакитний не забарвлював самі волокна. В дермі спостерігались світло-блакитні/синювато-зелені структури з гіалуроновою кислотою, які в основному відповідали основній речовині, що частково розчинилась при приготуванні гістологічних препаратів. На мал. lAb добре видно інтенсивно забарвлений альціановим блакитним матеріал в гіподермі внаслідок високого вмісту пегильованої гіалуронової кислоти, яка уводилась в цю ділянку шкіри.

При більш сильному збільшенні деяких ділянок гіподерми (мал. 2) добре видно компактно розташовані та видовженої форми ділянки філеру, зафарбованого алціановим блакитним (мал. 2a, b). Ці ділянки матеріалу з високим накопиченням алціанового відповідали скупченням пегильованої гіалуронової кислоти між світлими колагеновими волокнами, що, як відомо, не фарбуються алціановим блакитним.

Морфологічні зміни в шкірі після обробки пегильованим філером

Мал. 1. Сагітальні зрізи шкіри. Шари шкіри: епідерміс (ЕP), дерма (D) та гіподерма (НD). Малюнок НЕ – фарбування гематоксиліном та еозином. Філер видно як світло-блакитні ділянки між колагеновими волокнами (червоні в D та HD). Нижня частина HD: видно кластери адипоцитів (білого кольору). Ab: фарбування алціановим блакитним. Видно філер (блакитного кольору) між колагеновими волокнами (не забарвлені). Розмір масштабної риски: 100 мкм.

Всередині цих скупчень, що широко інтегровані в субдермальну сполучну тканину, можна виявити тонкі структури, утворені інтенсивно забарвленими волоконцями, що організовані подібно до тривимірної сітки (мал. 2c, d). Між цими ділянками видно поперечні перерізи потових залоз та їх проток, які мають вигляд слабко забарвлених округлий утворень (мал. 2a).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Морфологічні зміни в шкірі після обробки пегильованим філером

Мал. 2 a, b, c, d) Зрізи гіподерми, забарвлені альціановим блакитним. a) Компоненти потових залоз (ледь забарвлені округлі структури справа) в оточенні філера (блакитного кольору). Видно, що гіалуронова кислота філера широко інтегрована до основної речовини. Розмір масштабної риски: 100 мкм. b) Колагенові волокна (скісні структури зверху-справа, що не забарвлені або ледь забарвлені) частково вкриті та інтегровані з філером (блакитного кольору). Розмір масштабної риски: 10 мкм. c) Сітчаста структура забарвленого алціановим блакитним матеріалу. Розмір масштабної риски: 10 мкм. d) Мікроскопія та візуалізація з інтерференційним контрастом. Надтонка структура пегильованої ГК у вигляді сітчастого матеріалу. Також видно фібробласти з продовгуватою цитоплазмою. Розмір масштабної риски: 5 мкм.

При сильному збільшенні альціанофільних структур на інтерференційному мікроскопі сітчастий матеріал показав тонко структуровану організацію перехресних зв’язків, в яких комплекси гіалуронової кислоти з полімером ПЕГ утворювали тривимірну мережу з комірками різного розміру (мал. 2d, 3), і стабілізаційні зв’язки між двома полімерами мали вигляд вузлів. Ця комплексна тривимірна структура (мал. 3) утворювала молекулярну архітектуру взаємопроникної полімерної мережі і за рахунок великої площі поверхні молекул із значною кількістю вільних полярних груп забезпечувалось надзвичайно ефективне зв’язування молекул води, і ці молекули води додатково збільшували об’єм філера в обробленій тканині.

В зрізах забарвлених ГіЕ (мал. 4) також спостерігались тонкі зв’язки між різними компонентами гіподерми та складниками уведеного філера. На цих зрізах уведений матеріал мав світло-блакитне забарвлення (мал. 4a, b), був оточений жировою тканиною і перемежовувався колагеновими волокнами (мал. 4a). Спостерігалось інтенсивне забарвлення потових залоз та їх протоків, що мали вигляд округлих утворень з чіткими границями (мал. 4a). На мал. 4b матеріал філера безпосередньо та рівномірно межує з колагеновими волокнами без будь-якої інкапсуляції.

Фібробласти також досліджувались електронною мікроскопією для виявлення можливих цитологічних змін, спричинених філером. Характерні тонкі структурні особливості фібробластів показані на мал. 5. Ядра містять велику кількість диспергованого хроматину (еухроматину – активної форми хроматину) і всередині ядер видно великі ядерця (місце синтезу рибосом та органел, що приймають участь в синтезі білків). В цитоплазмі видно дуже розгалужену шорстку ендоплазматичну сітку з розширеними цистернами, що містять матеріал з тонкими волоконцями. У фібробластах у великій кількості представлено інші органели – комплекси Гольджі. Як видно на малюнку, вони характеризуються опуклими/заглибленими наборами мембранних цистерн із асоційованими судинами.

В живій клітині пухирці динамічно рухаються від шорсткої ендоплазматичної сітки до комплексів Гольджі і від комплексів Гольджі до плазматичної мембрани, за рахунок чого до позаклітинного матриксу постачаються нові молекулярні компоненти.

Що стосується можливих ознак імунологічних чи інших небажаних побічних реакцій в сполучній тканині, то дослідження не виявило запальних клітин чи гранульоми.

ОБГОВОРЕННЯ

Описані вище спостереження показали безпечність досліджуваного філеру та відсутність будь-яких ознак стимуляції імунної системи та (або) небажаних побічних реакцій. Біосумісність та безпечність досліджуваного філера забезпечувались виробництвом гіалуронової кислоти за допомогою генетично модифікованої лінії Bacillus subtilis, в яку було вбудовано ген кодування ферменту синтази гіалуронової кислоти (цей ген вилучено з геному S. equisimilis) (6). Отримана таким чином ГК потім модифікувалась сполученням з ПЕГ. Внаслідок пегилювання до ГК переносились такі корисні властивості ПЕГ, як гідрофільність, відсутність токсичності й імуногенності, а також забезпечувався додатковий захист від ризику імунологічних небажаних побічних реакцій (14). Якщо прийняти до уваги, що спостереження авторів були отримані за вісім місяців після ін’єкції філера, то це означає, що більша частина описуваного матеріалу утримувалась в тканині гіподерми, матеріал мав дуже низьку розчинність та дуже обмежене поширення за межі ділянки ін’єкції.

Уведений філер гармонійно вбудовувався до внутрішніх структур сполучної тканин, зокрема до колагенових волокон, кровоносних і лімфатичних судин, залоз і нервів. За рахунок пегилювання філер набував виняткових реологічних властивостей, а саме зв’язуваність, в’язко-еластичність та пластичність, оптимально адаптувався до обробленої анатомічної області, і водночас утримував задану форму, що забезпечувало довгострокову естетичну корекцію. Це дослідження чітко продемонструвало обмежене поширення філера за межі ділянки уведення, незначний вплив на положення колагенових волокон, залоз та інших стаціонарних структур підшкірної і дермальної сполучної тканини. Заданий об’єм зберігався без будь-яких ознак нефізіологічного тиску на прилеглі тканини.

Морфологічні зміни в шкірі після обробки пегильованим філером

Мал. 3. Інтерференційна світлова мікроскопія із дуже сильним збільшенням. Організація молекулярного комплексу пегильованого філера забарвлена алціановим блакитним. У тривимірній мережі з різним розміром вузлів видно місця зв’язування полімерів. Розмір масштабної риски: 5 мкм.

Морфологічні зміни в шкірі після обробки пегильованим філером

Мал. 4. Сагітальні зрізи гіподерми, забарвлені гематоксиліном та еозином. a) Філер (світло-блакитний, позначено зірочками) повністю вбудований до сполучної тканини між колагеновими волокнами (червоні), жировою тканиною (біла) та деякими протоками потових залоз (стрілки). Розмір масштабної риски: 100 мкм. b) Позаклітинний матрикс гіподерми. Колагенові волокна (CF, червоні) мають різну орієнтацію, безпосередньо межують з філером (світло-блакитний, зірочки) без будь-яких ознак інкапсуляції. Зліва: малий вивідний проток (стрілка) та мала артеріола. Розмір масштабної риски: 20 мкм a) і b) Не виявлено жодних ознак імунологічних реакцій чи відповідних клітин.

Філер не лише відновлює об’єм та підтримує сполучну тканину у якості ін’єкційної речовини, але й також забезпечує зв’язування значної кількості молекул води полярними групами, що у великій кількості містяться в молекулярній структурі цього філера (15). За рахунок цього корисного ефекту відбувається інтенсивна та тривала гідратація позаклітинного матриксу сполучної тканини, що супроводжується підвищенням проникної здатності позаклітинного матриксу і більш ефективною дифузією поживних речовин з кровоносних судин до шкіри загалом, і епідермісу зокрема, відновлюючи гомеостатичний баланс молодої шкіри.

Результати дослідження електронною мікроскопією показали у фібробластах певні тонкі структурні зміни ядер та цитоплазматичних органел (розширені цистерни шорсткої ендоплазматичної сітки та видовжені комплекси Гольджі), які вказують на функціональну стимуляцію, відновлення активності синтезу глікопротеїнів і білків та наступне їх виділення до позаклітинного матриксу. Зокрема, матеріал всередині розширених цистерн був дуже подібний до проколагену (16), який є молекулярним попередником колагену та інших білків, які динамічно транспортуються до комплексів Гольджі і там гліколізуються. Молекули проколагену через пухирці комплексів Гольджі у формі молекул тропоколагену постачаються до позаклітинного матриксу, де відбувається утворення фібрил колагену. Інші пухирці комплексів Гольджі постачають інші глікопротеїни та протеоглікани для формування основної речовини. Ці спостереження свідчать про відновлення активності фібробластів з активної регенерації міжклітинних компонентів сполучної тканини (колагену, глікопротеїнів, глікозаміногліканів). Таким чином, додатковим корисним ефектом описуваного філера є поновлення виробництва молекулярних компонентів позаклітинного матриксу. Цей ефект разом з високим ступенем гідратації позаклітинного матриксу забезпечує додаткову природну дію філера, підвищуючи естетичні результати та функціональну синергію зі звичайними ефектами ін’єкційного філера.

Морфологічні зміни в шкірі після обробки пегильованим філером

Мал. 5. Зображення під електронним мікроскопом. Фібробласти з високою еухроматичністю ядер (N), ядерця (Nus) та підвищений вміст в цитоплазмі шорсткої ендоплазматичної сітки (RER) із значним вмістом розширених цистерн в рибосомах. Розмір масштабної риски: 500 нм. На вставці (зверху-справа): комплекси Гольджі (G) з розширеними мембранами та відповідними пухирцями. Розмір масштабної риски: 500 нм.

Адреса для листування: д-р Нікола Зербанаті (Nicola Zerbinati), відділення хірургічних та морфологічних наук, університет Інсубріа, м. Варензе, Італія

Ел. пошта: nzerbinati@centro-medico.it

0393-974X(2016)

Copyright © by BIOLIFE, s.a.s. Ця публікація (стаття) виключно для індивідуального використання і не призначена для тиражування без письмового дозволу власника авторських прав. Несанкціоноване тиражування статті може бути покаране штрафом або іншими видами переслідування.

КОНФЛІКТ ІНТЕРЕСІВ: АВТОРИ СТАТТІ ЗАЯВИЛИ ПРО ВІДСУТНІСТЬ КОНФЛІКТУ ІНТЕРЕСІВ.