Вступление
Neauvia Stimulate® — это биологически совместимый инъекционный филлер на основе гиалуроновой кислоты (ГК) (26 мг/мл) сшитой из ПЭГ и 1% гидрокиапатита кальция (КаГА), предназначенный для реконструкции мягких тканей лица с предоставлением тканям дополнительного объема за счет неокологенеза, улучшающего качество кожи. Задачей данного исследования была оценка возможных изменений синтеза коллагена после обработки исследуемым продуктом (партия 160517-26-1/2 PEG) человеческих фибробластов в условиях in vitro.
Несмотря на in vitro условия, предложенная экспериментальная модель предоставляла полезную информацию, позволяющую предусмотреть возможную активность изучаемого продукта при in vivo применении в будущем. Человеческие фибробласты (клетки PEU) в течение 24 часов обрабатывались увеличивающимися концентрациями исследуемого продукта и сравнивались с контролем (необработанные клетки).
Модуляция синтеза коллагена оценивалась с помощью специального колориметрического набора (Sircol, Soluble Collagen Assay Kit). Имел место статистически значимый рост производства коллагена на 37.62% и 97.39% после обработки исследуемым продуктом в концентрации соответственно 1.25 мг/мл и 2.5 мг/мл (* значения p<0.05 и ** значение p<0.01) относительно контроля (необработанные клетки ). В заключении указано, что гидрогель гиалуроновой кислоты 26 мг/мл сшит из ПЭГ и низкой концентрацией гидроксиапатита кальция (1%) обеспечивает статистически значимое усиление неокалогенеза.
Neauvia Stimulate® (MatexLab SA, г. Лугано, Швейцария) – это продукт, сочетающий чистую гиалуроновую кислоту пробиотического происхождения (Bacillus Subtilis) сшитой из ПЭГ (полиэтиленгликоль) и низкой концентрацией (1%) макромолекул (10-12 ) гидроксиапатита кальция. Этот продукт относится к «гибридным» филерам (полная биологическая совместимость и биоразложение), которые одновременно обеспечивают коллагенез и эффект увеличения объема, типичный для пегилированных ГК филлеров (1,2, 3) («пегилированный» или «сшитый» означает образование перекрестных). связей с полиэтиленгликолем). Коллагенез достигается за счет действия гидроксиапатита кальция, стимулирующего эндогенное производство коллагена в коже (4, 5, 6, 9).
Задачей представленной работы была оценка возможной модуляции синтеза коллагена после обработки культивируемых в условиях in vitro человеческих фибробластов гидрогелем гиалуроновой кислоты 26 мг/мл, сшитой из ПЭГ и 1% гидроксипатитом кальция (партия 160517-26-1/2). Несмотря на условия in vitro, предлагаемая экспериментальная модель предоставляет полезную информацию, позволяющую предусмотреть возможную активность исследуемого продукта при in vivo применении в будущем.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Приготовление изучаемого образца
Пегилированный гидрогель гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) взвешивался и растворялся в концентрации 5 мг/мл в полной питательной среде MEM с 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FBS), 1 глутамина и антибиотиками (пенициллин 100 МЕ/мл и стрептомицин 100 пг/мл). В качестве положительного контроля использовалось хорошо известное цитотоксическое вещество лаурилсульфат натрия (ЛСН), которое готовилось так же, как и исследуемый продукт.
Клеточные культуры
Фибробласты – это клетки соединительной ткани, производящие компоненты внеклеточного матрикса. В эксперименте использовалась человеческая клеточная линия нормальных эмбриональных фибробластов (PEU, код BS CL 97). Клеточная линия выращивалась в условиях полной стерильности и инкубировалась при 37°C в атмосфере из 5% оксида углерода.
Анализ цитотоксичности (тест MТT)
Тест МТТ – это колориметрический анализ цитотоксичности, используемый для оценки пролиферации клеток и их жизнеспособности на основе митохондриальной эффективности. МТТ – это соль тетразолия, которая при наличии метаболической активности в клетке восстанавливается метохондриальной дегидрогеназы в среде митохондрии жизнеспособной клетки. Восстановление МТТ приводит к образованию кристаллов формазана (рисунок 1), которые не растворяются в культуральной среде, но растворяются в диметилсульфоксиде, в результате чего митохондрия жизнеспособной клетки окрашивается в типичный пурпурный цвет. В пораженной или погибшей клетке активная митохондрия отсутствует, поэтому МТТ не производится и, соответственно, не происходит интенсивной окраски в пурпурном цвете (7). Существует прямая связь между жизнеспособностью и клеточным дыханием, поэтому МТТ было признано надежным анализом для выявления нецитотоксических концентраций гидрогеля пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG).
При подготовке к анализу клетки PEU равномерно высевались на 96-луночные планшеты с плотностью 1.5 x 104 клеток/лунка, после чего проводилась инкубация при 37°C во влажной атмосфере с 5% содержанием углекислого газа. Через 24 часа выполнялась обработка клеток (6 репликаций каждой лунки 8 разными концентрациями), начиная с концентрации 5 мг/мл и до конечной концентрации 0.039 мг/мл с последовательным разведением 1:2. В качестве положительного контроля использовались клетки, обработанные ЛСН (Ктрл+, начальная концентрация в полной среде 5 мг/мл).
Инкубация длилась 24 часа. После этого к клеткам PEU добавлялось 10 мкл основного раствора МТТ (5 мг/мл в фосфатном буферном растворе) при 37°C в 2 часа. После этого удалялась культуральная среда и к клеткам добавлялось 100 мкл диметилсульфоксида. Измерялось оптическое поглощение на длине волн 570 нм микропланшетным ридером (Tecan Sunrise). Жизнеспособность клеток рассчитывалась по разности оптической плотности каждой из восьми исследуемых концентраций испытуемого продукта в отношении контроля (необработанные клетки) (8).
Оценка синтеза коллагена
Способность гидрогеля пегилированной гиалороновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) модулировать производство коллагена оценивалась в человеческих фибробластах (клетки PEU) после 24-часовой обработки исследуемым продуктом. Для измерений использовался колориметрический набор (Sircol, Soluble Collagen Assay Kit). При подготовке к анализу клетки PEU равномерно высевались на 96-луночные планшеты с плотностью 8 x 104 клеток/лунка, после чего проводилась инкубация при 37°C во влажной атмосфере с 5% содержанием углекислого газа.
Через 48 часов исследовались две концентрации испытуемого продукта, 1.25 и 2.5 мг/мл, выбранные из-за отсутствия цитотоксичности и хорошей растворимости (необходимой для МТТ теста). В качестве контроля использовались необработанные клетки (КТРЛ). После инкубации к образующемуся супернатанту добавлялось 200 мкл Tris-HCl (pH 7.4) с полиэтиленгликолем для отделения и концентрирования коллагена. После этого – хранение в течение ночи при 0 – 4°C. В дальнейшем образцы центрифугировались при 12 000 об/мин. и инкубировались 10 минут с реактивом «краситель Sircol», способным связываться с коллагеном. За это время образовывались комплексы коллаген-краситель, которые осаждались из раствора несвязанного красителя. После центрифугирования (10 минут со скоростью 12 000 об/мин) добавлялся реактив с гидроксидом натрия 0.5 M, растворявший осажденный коллаген. Затем 200 мкл образца переносилось на 96-луночный планшет для спектрофотометрического измерения оптической плотности на длине волн 555 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Оценка жизнеспособности клеток
Полученные результаты сообщались в форме таблиц и графиков, содержащих данные измерений синтеза коллагена после обработки гидрогелем пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) по сравнению с контрольными клетками PEU. Данные сообщались как средние значения ± стандартное отклонение (SD) по меньшей мере для двух выполненных независимых экспериментов.
Клетки PEU инкубировались и обрабатывались в течение 24 часов 8 концентрациями гидрогеля пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) и соответствующим положительным контролем для определения рабочих концентраций для дальнейшего анализа. На рис. 2 показаны результаты испытания цитотоксичности. На этом графике видно, что все испытанные концентрации гидрогеля пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) не обладали цитотоксической активностью.
В таблице 1 для каждой проверенной концентрации показаны данные измерений, представленные в процентах относительно контроля (необработанные клетки). Из этих данных следует, что при всех испытанных концентрациях гидрогель пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) не обладал цитотоксической активностью. Для дальнейшего анализа были выбраны рабочие концентрации 1.25 мг/мл и 2.5 мг/мл из-за их хорошей растворимости в культуральной среде.
Оценка синтеза коллагена
Клетки PEU обрабатывались (инкубация 24 часа) двумя разными концентрациями гидрогеля пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) (2.5 мг/мл и 1.25 мг/мл) для исследования степени возможной модуля коллагена. На рис. 3 представлены результаты обработки клеток PEU гидрогелем пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) в концентрации 1.25 мг/мл и 2.5 мг/мл. Эти результаты показывают, что по сравнению с контролем (КТРЛ, необработанные клетки) 24-часовая обработка клеток PEU обеими рабочими концентрациями исследуемого продукта повышала уровень синтезированного коллагена соответственно на 37.62% и 97.39%.
ВЫВОДЫ
На основании результатов in vitro испытаний авторы пришли к выводу, что гидрогель пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) вызывал статистически значимое повышение синтеза коллагена человеческими фибробластами после их 24-часовой концентрации. исследуемого гидрогеля. В частности, рабочие концентрации гидрогеля пегилированной гиалуроновой кислоты 26 мг/мл (партия 160517-26-1/2 PEG) 1,25 мг/мл и 2,5 мг/мл повышали производство коллагена в клетках PEU соответственно на 37.62% и 97.39%.
Адрес для переписки:
- Д-р Роберто Мокчи (Roberto Mocchi)
- UB-CARE S.r.l.
- Университет г. Павия, Италия
- Тел.: 0382 986040
- Эл. почта: marketing@ub-careitaly.it
- 0393-974X (2016)
Copyright © by BIOLIFE, s.a.s. Настоящая публикация (статья) исключительно для индивидуального использования и не предназначена для тиражирования без письменного разрешения владельца авторских прав. Несанкционированное тиражирование статьи может быть наказано штрафом или другими видами преследования.